De son vrai nom Clarence LeRoy Van Cleef, Jr., il est le fils de Clarence LeRoy Van Cleef, Sr., descendant de colons néerlandais, et Marion Levinia (née Van Fleet)
Il a servi dans l’US Navy durant la Seconde Guerre mondiale.
Il était un spécialiste des seconds rôles de méchant dans les westerns (Le train sifflera trois fois, 1952). Il s'y cantonne souvent à des personnages muets ou presque. À la suite d'un grave accident de voiture, il mit fin à sa carrière. Ensuite, il fut redécouvert par Sergio Leone dans Et pour quelques dollars de plus. Ce premier grand rôle marquera le début de sa seconde carrière, dans le western spaghetti. C'est là qu'il devint une star internationale, au cours des années 1960, incarnant magistralement Sentenza dans Le Bon, la Brute et le Truand. Il reste par ailleurs un des plus grands représentants de ce genre.
Il a également joué dans de nombreuses séries télévisées, notamment L'Homme au katana où il interprète un blanc initié aux techniques de combat des ninjas. La série a été découverte en France sur M6 en 1987 et ne compte que 13 épisodes1. Il incarne un bandit dans l'épisode 1 de la 2e saison de Zorro et un déserteur dans la saison 1 de Rintintin.
Lee Van Cleef a perdu la dernière phalange du majeur de sa main droite alors qu'il bricolait une chambre de jeu pour sa fille2, visible dans la scène finale de Le Bon, la Brute et le Truand. Il est mort d'une crise cardiaque le 16 décembre 1989 à Oxnard en Californie, il repose au cimetière du Forest Lawn Memorial Park des collines d'Hollywood à Los Angeles.
